在中枢神经系统肿瘤诊断中的典型应用
在手术处理中枢神经系统肿瘤时，术中快速病理诊断是一个非常重要且实用的手段，尤其是对于肿瘤性质和边界的判断。
目前传统术中快速诊断还是通过病理医师对HE染色或是甲苯胺蓝（toluidinblu）染色（细胞学印片）的切片进行形态学观察做出判断，但其诊断准确率不是很高，只有约50%～96%。
本实验室既往曾经回顾了近年来例冰冻切片诊断，并与最终石蜡切片诊断进行比对，分析其诊断符合率及误诊率，结果发现中枢神经系统疾病冰冻切片诊断的误诊率较其它脏器相对较高，国内文献报道误诊率在1.6%～9.6%。
结合病例资料分析，我们认为主要有以下几方面原因：
1.颅脑手术视野小，病变位置深，尤其是近年来立体定向穿刺的应用，导致取材部位不准确或根本未取到病变，影响诊断结果；
2.送检标本太小，经冰冻切片不能看到病变的全貌；
3.病理切片质量不稳定，包括厚薄不均，染色深浅不一，透明度不好以及较常出现一些人工假象；
4.手术医生提供临床资料不全或不准确；
5.主诊病理医师对诊断标准掌握不准，对冰冻切片与石蜡切片的区别了解不够或偶尔的先入为主也可导致误诊。
从我们分析的结果可以看出，误诊率最高的肿瘤主要是是血管外皮瘤、血管母细胞瘤、淋巴瘤、及少见的软组织肉瘤，其次为少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、转移癌。其中胶质瘤、淋巴瘤和转移癌的诊断的确立对神经外科术中处理方式极为关键而显得尤为重要。
而在中枢神经系统肿瘤中鉴别不典型的胶质瘤、淋巴瘤和转移癌往往困难，因为这几种肿瘤在冰冻切片上细胞密度、核异型性、核分裂像以及坏死形态学上具有相似性。
加之脑肿瘤富含水和脂肪成分，较其他组织更为“软”，所以高质量的冰冻切片不易制备，也导致诊断相对困难，所以有时病理医师难以在术中短时间内根据HE染色切片给出准确诊断和鉴别诊断。
很长一段时间以来，病理学家和肿瘤学家都在寻找能辅助术中快速诊断的方法。免疫组化染色（IHC）在肿瘤诊断中是一种非常有用的技术，然而传统的实验过程需要分钟以上才能完成，因此在术中应用是不实际的。
在过去几年中，人们积极地探索了一些快速的IHC方法，如基于AC电场促进抗原-抗体反应的R-ICC（快速免疫细胞化学）、基于罗氏VntanaBnchMarkUltra平台的自动快速冰冻染色等。
基于微波技术的R-ICC（快速免疫细胞化学）应用于胰腺癌或胆管癌术中腹腔灌洗液细胞学检测已有报道。也有研究应用R-ICC（快速免疫细胞化学）技术进行细胞角蛋白染色来判断乳腺癌前哨淋巴结细胞学印片中有无癌组织转移。
随着NovodiaxihcDirc技术出现，相关快速免疫组化方法（R-IHC）的建立，使得术中应用成为可能。NovodiaxihcDirc技术是将多聚HRP直接连接到一抗上，缩短了免疫组织化学的反应步骤，整个染色过程仅仅耗时20分钟，帮助病理医师得到客观诊断依据，从而使术中进行免疫组化染色成为可能。
为了测试这项新技术在中枢神经系统的应用，我们选取了胶质瘤、淋巴瘤和转移癌这几个常见且误诊率高、误诊对临床处置影响大的病例进行术中快速免疫组化染色辅助进行鉴别诊断。
冰冻切片采取5μm切片进行HE染色和快速免疫组化染色（包括手动和自动两种染色方式）。同一肿瘤标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，制成常规切片进行HE染色和标准免疫组化染色。
手工法快速免疫组化需将冰冻切片在固定液中（25ml冰醋酸，ml37%甲醛，ml甲醇）及时固定至少30秒。然后参照试剂盒说明书步骤进行，整体时间约为10min左右。（鉴于实际工作中，冰冻值班人员要兼顾制片、行快速免疫组化及实验稳定性，综合考虑，本实验室进行了开放式自动免疫组化仪行相关NovodiaxihcDirc技术机染法的设计与尝试）。
行机染快速免疫组化需预先把固定液、通用IHC封闭液以及一抗（PolyHRP-GFAP/LCA/CK-pan）加注到专用试剂瓶中并在自动免疫组化仪系统中注册然后进行染色。注册然后进行以下步骤（编程设定LicaBiosystm为模型，见表1）。
表1R-IHCLicaBondⅢ机染步骤
染色结果如下图所示。快速免疫组化染色结果良好且阳性信号定位准确，无假阳性或假阴性出现。与手工染色相比机染效果明显优于前者，且机染效果稳定、重复性好（无边缘效应、异染褶皱等）、易于质控。
自动染色机能使反应试剂更均匀地分布在组织表面，反应面也更加平坦，大流量缓冲液的冲洗使每次反应步骤后试剂无残留，保证了最终染色背景干净清晰，自动染色结果与常规IHC相似。
通过我们的探索证实，NovodiaxihcDirct技术结合全自动免疫组化仪染色是可行而实用的，并且我们建立的自动染色程序步骤也是可行的。虽然自动染色也有一些缺点，如反应时间长，抗体成本比手工染色高，但自动染色具有良好的重复性和质量控制，可以节省人力，并且易于实现标准化流程。此外，在术中使用快速免疫组化辅助诊断后胶质瘤、淋巴瘤和转移癌的误诊率明显下降。
随着这一技术的应用，中枢神经系统（CNS）肿瘤术中诊断流程可以得到优化，结合MDT术前充分了解病人病史，病理医师可在冰冻标本大体检查后选择合适的免疫组化指标，制定鉴别诊断免疫组化应用组合，在提高诊断准确前提下精准选用抗体，直接进行冰冻切片R-IHC自动染色，即常规冰冻HE染色和R-IHC同时进行减少时间消耗。
目前，Novodiax还在继续开发更多的ihcDirct抗体，如异柠檬酸脱氢酶（IDH）抗体、突触素抗体（Syn）、生殖系统肿瘤相关抗体等，与之对应的全自动快速免疫组化仪也在研发中，这将为今后R-IHC自动染色技术提供更广阔的应用前景。
术中快速免疫组织化学的应用为术中冰冻诊断提供了非常大的帮助，当然这也对病理技术工作提出了更大的挑战，对冰冻制片提出了更高的要求。快速免疫组化所使用的试剂质控问题也亟需解决——如果没有很好的试剂质控，染色结果就不可靠，导致不仅不能辅助诊断，反而会造成误诊。
这可能需要生产厂家和我们使用者共同努力，建立一个相对合理而且具有可行性的指导框架。术中快速冰冻诊断，病理医师需要不断提高自己的业务能力积累经验，尽力做到临床-影像-病理的三结合，加之合理的选择新技术，正确地对结果进行判读，努力提高诊断正确率。
图R-IHC染色结果
本文来源：衡道病理本文作者：HISTOPATH责任编辑：高洁版权申明本文转载欢迎转发朋友圈-End-*医学界力求其发表内容在审核通过时的准确可靠，但并不对已发表内容的适时性，以及所引用资料（如有）的准确性和完整性等作出任何承诺和保证，亦不承担因该些内容已过时、所引用资料可能的不准确或不完整等情况引起的任何责任。请相关各方在采用或者以此作为决策依据时另行核查。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇